La naissance de l'Ordre remonte aux environs de 1050. Selon les chroniqueurs, des marchands de l'ancienne république d'Amalfi ont obtenu du calife d'Egypte l'autorisation de construire à Jérusalem une église, un couvent et un hôpital destinés à soigner les pèlerins malades - sans distinction de race ou de religion. Les Hospitaliers de St-Jean de Jérusalem - la communauté monastique qui administrait l'hôpital pour les pèlerins en Terre Sainte - deviennent un Ordre religieux, indépendant, sous la conduite du bienheureux Gérard. En effet, par une bulle papale promulguée le 15 février 1113, le Pape Pascal II consacra la fondation de l'Ordre et le plaça sous la protection du Saint-Siège, lui assurant le droit d'élire ses chefs sans l'intervention d'aucune autre autorité ecclésiastique ou laïque.

Le rôle de l'Ordre était de soigner et de défendre les malades et les pèlerins dans les territoires que les croisés avaient reconquis aux musulmans. L'Ordre devint ainsi à la fois religieux, hospitalier et militaire. Certains de ses membres sont des religieux qui ont prononcé les trois vœux de pauvreté, de chasteté et d'obéissance, tandis que la majorité de ses Chevaliers et Dames sont des laïcs, parmi lesquels certains ont fait promesse d'obéissance (Chevaliers en Obédience).

L'Ordre adopta la croix blanche à huit pointes qui est encore aujourd'hui le symbole de St-Jean, et élargît sa mission à la défense de la chrétienté.

1310 : Rhodes

Lorsque le dernier bastion de la chrétienté en Terre Sainte tomba, l'Ordre s'établit d'abord à Chypre puis sur l'île de Rhodes en 1310 sous la conduite du Grand Maître Frà Foulques de Villaret. Dorénavant, la défense du monde chrétien exigeait la mise sur pied d'une force navale. Dès lors, l'Ordre bâtit une puissante flotte pour sillonner la Méditerranée orientale et s'engagea dans de nombreuses et célèbres batailles pour la chrétienté - les croisades de Syrie et d'Egypte par exemple.

Dès les origines, l'indépendance vis-à-vis des autres nations garantie par le Pape, ainsi que le droit universellement reconnu de maintenir et déployer des forces armées, ont constitué les bases de la souveraineté internationale de l'Ordre.

Au début du 14e siècle, les membres de l'Ordre résidant à Rhodes étaient originaires de toutes les parties de l'Europe. Les établissements de l'Ordre en Europe furent rassemblés en 7 groupes ou langues : Provence, Auvergne, France, Italie, Aragon (Navarre), Angleterre (avec l'Irlande et l'Ecosse) et Allemagne. En 1492, la Castille et le Portugal se séparèrent de la langue d'Aragon et constituèrent un huitième groupe. Chaque langue était composée de Prieurés et Grands Prieurés, de Bailliages et de Commanderies.

L'Ordre était gouverné par le Grand Maître (le prince de Rhodes) et un Conseil, battait sa monnaie et maintenait des relations diplomatiques avec les autres Etats. Les Hautes Charges de l'Ordre étaient attribuées aux représentants des différentes langues et au siège de l'Ordre, le Couvent, se rassemblaient des membres de différentes nationalités ou langues.

1530 : Malte

Après six mois de siège et de féroces combats contre la flotte et l'armée du sultan Soliman le Magnifique, les Chevaliers furent contraints de se rendre en 1523. Ils quittèrent Rhodes avec les honneurs militaires. L'Ordre resta sans territoire propre jusqu'en 1530, date à laquelle le Grand Maître Frà Philippe de Villiers de l'Isle Adam prit possession de l'île de Malte, cédée par l'empereur Charles Quint avec la bénédiction du pape Clément VII. Il fut stipulé que l'Ordre devait rester neutre en cas de guerre entre les nations chrétiennes. En 1565, les Chevaliers, sous la conduite du Grand maître Frà Jean de la Vallette (qui donna son nom à la capitale de Malte, la Valette), défendirent l'île assiégée par les Turcs pendant trois mois.

1571 : La bataille de Lépante

La flotte de l'Ordre, alors l'une des plus puissantes flottes de la Méditerranée, contribua à la destruction totale de la puissance navale ottomane à la bataille de Lépante en 1571.

1798 : L'exil

200 ans plus tard, en 1798, Napoléon Bonaparte, en route pour l'Egypte, occupa l'île. Les Chevaliers, en vertu de la règle qui les empêchaient de mener combat contre les autres puissances chrétiennes, furent contraints de quitter Malte. En 1800, les Anglais occupèrent Malte, et malgré la reconnaissance des droits souverains de l'Ordre sur l'île par le traité d'Amiens (1802), l'Ordre ne put jamais reprendre possession de l'Ile de Malte.

1834 : Rome

Après avoir résidé temporairement à Messine, Catane et Ferrare, l'Ordre s'établit à Rome en 1834 où il possède le Palais de Malte, 68 via Condotti, et la villa de l'Aventin, qui jouissent tous deux de l'extraterritorialité.

Les XXème et XXIème siècles

A dater de cette époque, les œuvres hospitalières et charitables devinrent la seule mission de l'Ordre et elles se développèrent tout au long du siècle dernier grâce à la contribution des Prieurés et des Associations nationales de l'Ordre présents à travers le monde.
Des activités hospitalières et caritatives furent lancées sur une grande échelle pendant les deux premières guerres mondiales, continuées sous la conduite de Frà Angelo de Mojana di Cologna (1962-1988), et poursuivies par ses successeurs, Frà Andrew Bertie (1988-2008), et l'actuel Grand Maître, Frà Matthew Festing .